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Targeted Protein Degradation
靶向蛋白降解
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Promega用于PROTAC研发相关的检测方法是基于生物发光法，灵敏度高，可在活细胞水平进行长达72小时实时监测内源性蛋白水平的降解，简单的加入-读取操作，实现真正高通量筛选，可叠加细胞健康及能量代谢多重指标，帮助您寻找合适的靶点。
我的靶蛋白是否被泛素化？
Does My Target Become Ubiquitinated?
细胞水平检测方法
| NanoBRET™技术可用于靶标蛋白泛素化动力学检测或是终点法检测模式，可用于测量化合物剂量-响应曲线等应用。 在NanoBRET™泛素化检测中，靶标蛋白作为能量供体，并在细胞中与外源性瞬时的NanoLuc®融合表达，或在表达LgBiT的细胞中与内源性标记的HiBiT融合表达。外源性表达的HaloTag-Ub作为能量受体。活细胞NanoBRET™检测的实时性可使用终点法或动力学分析。与三元复合物的形成类似，泛素化的变化一般发生在化合物添加后的1 ~ 4小时内。 |  |
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| BRD4泛素化的动力学监测。通过CRISPR/Cas9基因编辑，将HiBiT插入到HEK293 LgBiT细胞系的内源性BRD4位点。用HaloTag®-Ubiquitin受体质粒转染稳定的克隆。细胞经1μM MZ1或1μM dBET1处理后，使用NanoBRET™ Nano-Glo® Kinetic Detection Reagent测定靶标蛋白随时间的泛素化作用。 | | 使用活细胞终点法检测PROTAC处理后的BRD4泛素化。用NanoLuc®-BRD4和HaloTag®-Ubiquitin质粒转染HEK293细胞，供体与受体的比例为1:100，在HaloTag® NanoBRET™ 618 Ligand存在下进行处理，用10μM dBET1或MZ1 PROTAC化合物梯度稀释后处理1小时。对于这两种PROTACs，都观察到BRET比率呈现剂量依赖性增加。误差线表示标准偏差，n = 3。 | | 基于抗体的 PROTAC 活性测定。在指定时间用 1 μM 处理含有内源性标记的 HiBiT-BET 家族成员并表达 LgBiT 的 HEK293 细胞 dBET1 或 MZ1 PROTAC。用洋地黄皂苷裂解细胞，并与一代多克隆抗泛素和 Alexa Fluor® 594 一起孵育 10 分钟 荧光二抗，用于测定 NanoBRET® 比率。数据表示为通过归一化为 t = 0 时间的 NanoBRET® 值的倍数增加 点。变异性表示为 n = 3 个实验的 SEM。 |
生化水平检测方法
我们还提供生化方法，用于监测目标蛋白的泛素化过程。这里展示的例子使用Lumit®Immunoassay技术检测E3泛素连接酶Cbl-b的泛素化。
| 右图.生化方法监测目标蛋白泛素化的原理示意图。在必需泛素化组分E1、E2和ATP的存在下，Lumit® Immunoassay可以测量生物素化泛素与GST-Cbl-b之间的相互作用 |  |
上图. Cbl-b的自泛素化检测。图A. 在ATP存在下，Cbl-b-GST泛素化随Cbl-b-GST浓度依赖性增加导致发光信号增加。由于该过程依赖于ATP，在没有ATP的情况下，会有一个低背景信号。图B. 使用未标记生物素的泛素系列稀释液来竞争掉生物素化泛素，并导致发光信号随浓度依赖性降低。