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Targeted Protein Degradation
靶向蛋白降解
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Promega用于PROTAC研发相关的检测方法是基于生物发光法，灵敏度高，可在活细胞水平进行长达72小时实时监测内源性蛋白水平的降解，简单的加入-读取操作，实现真正高通量筛选，可叠加细胞健康及能量代谢多重指标，帮助您寻找合适的靶点。
我的靶蛋白是否被成功降解？
Bioassay Qualification
| HiBiT技术能够定量分析蛋白降解类药物的功能。HiBiT是一个11个氨基酸的多肽标签，与它的互补伴侣LgBiT具有很高的亲和力。它们共同组成了二亚单元发光蛋白，NanoBiT®萤光素酶。当使用CRISPR基因编辑技术将HiBiT引入内源性位点时， HiBiT- LgBiT一经结合，有活性的萤光素酶蛋白便产生了与内源性靶蛋白水平相关的非常明亮且高灵敏的读数。 添加能引起降解的化合物会导致发光信号的丢失，这个过程可以是高度定量和实时测量的。在24- 48小时内可以获得细胞的剂量响应曲线并进行实时监测，从而可以准确测定降解速率、Dmax、DC50值和蛋白水平恢复。这种方法允许对一系列不同的降解参数进行快速排序，并且该方法适用于高通量筛选。 | |
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PROTAC处理后的内源性HiBiT-BRD4降解动力学研究。将HiBiT插入至HEK293 LgBiT细胞系的内源性BRD4位点。细胞在含有Nano-Glo® Endurazine™ substrate的不依赖二氧化碳的培养基中用MZ1滴定处理。图A：动力学发光检测；图B：降解速率；图C: Dmax。
我的靶蛋白在天然（未修饰）细胞中是否降解？
Is My Target Degraded in Native (Non-Modified) Cells?
我们提供细胞水平的方法来监测目标蛋白在原生细胞中的降解。在这个例子中，使用Lumit®Immunoassay Cellular System来检测SMARCA4的降解。
Lumit® Immunoassay Cellular System 用于监测 SMARCA4 的降解
上图：裂解细胞中的 SMARCA4 被 anti- SMARCA4 一抗识别。然后，Lumit® 二抗识别它们的同源一抗，从而使 NanoBiT® 亚基紧密结合，形成功能性萤光素酶，可产生明亮发光信号。
上图：PROTAC 处理后天然的 SMARCA4 的降解。每孔接种 50,000 个细胞。用指定化合物处理后，使用 Lumit® Immunoassay Cellular System （set 2）检测 SMARCA4 的水平。图 A. 用 250nM ACBI-1、250nM ACBI-1 + 20µM MG132、250nM Cis-ACBI-1 或 DMSO 处理 5 小时后的 SMARCA4 水平。图 B. ACBI-1 在三种不同细胞系中对 SMARCA4 降解的分析。图 C. ACBI-1 降解 SMARCA4 的时间过程。
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