-
Targeted Protein Degradation
靶向蛋白降解
-
Promega用于PROTAC研发相关的检测方法是基于生物发光法，灵敏度高，可在活细胞水平进行长达72小时实时监测内源性蛋白水平的降解，简单的加入-读取操作，实现真正高通量筛选，可叠加细胞健康及能量代谢多重指标，帮助您寻找合适的靶点。
PROTAC是否形成了三元复合物？
Does My PROTAC Form a Ternary Complex?
细胞水平检测方法
| E3三元复合物(包括靶标蛋白、降解化合物和E3连接酶)的形成可能是靶标蛋白降解过程中最关键的步骤。这一步是开发和优化有效降解化合物的关键参数。NanoBRET™技术非常适合研究活细胞形式的三元复合物形成，同时适用于终点法检测或动力学分析。 在该方法中，靶标蛋白作为能量供体(生物发光)，在细胞中与外源性瞬时的NanoLuc®融合表达，或在表达LgBiT的细胞中与内源性标记的HiBiT融合表达。HaloTag®与von Hippel - Lindau (VHL)或cereblon (CRBN) E3连接酶组分融合，进行外源性表达，并用荧光配基标记，作为能量受体。 | |
上图. 利用活细胞终点法检测PROTAC诱导的BRD4 VHL/CRBN三元复合物的形成和BRD4蛋白水平。NanoLuc®-BRD4供体质粒与HaloTag®-VHL或HaloTag®-CRBN受体质粒以1:100的比例转染细胞(BRD4 /VHL检测)，用MG132预处理(或DMSO作为对照)，随后再用1µM MZ1 (基于VHL的PROTAC)或DMSO溶液处理。NanoBRET™比率表明三元复合物形成(图A)， NanoLuc®发光检测表明PROTAC处理导致的靶蛋白水平变化(图B)。
 | 左图. PROTAC处理后BRD4/VHL三元复合物形成的动态监测。通过CRISPR/Cas9基因编辑，将HiBiT插入到HEK293 LgBiT细胞系的内源性BRD4位点。用HaloTag®-VHL受体质粒转染稳定的克隆。在PROTAC处理前，用MG132预处理细胞。使用NanoBRET™ Nano-Glo® Kinetic Detection System 检测NanoBRET™信号，实时监测三元复合物的形成。 |
生化水平检测方法
我们还提供生化方法，用于监测不同E3泛素连接酶、目标蛋白和小分子PROTAC之间三元复合物的形成。下面的例子使用Lumit®Anti-Tag Protein Interaction Reagents来检测PROTAC介导的与cereblon和VHL复合物形成的三元复合物。
 | 监测三元复合物形成的生化方法示意图。以BRD3(BD2)作为目标蛋白，使用anti-FLAG-LgBiT和抗anti-GST-SmBiT Lumit® reagents，可以监测PROTAC介导的三元复合物形成。 |
上图. Lumit™Anti-Tag Protein Interaction Reagents可以确定不同PROTAC的相对效力。图A. 与cereblon复合物+BRD3(BD2)和dBET1或dBET6形成的三元复合物。图B. 与VHL复合物+BRD3(BD2)和ARV-771或MZ1形成的三元复合物。这些实验表明dBET6比dBET1更有效力，并且显示出ARV-771和MZ1之间效力相似。在这两个系统中，在高浓度PROTAC下观察到特征性的钩状效应。