答：

1) 引物浓度太高，与 GoTaq qPCR Master Mix 试剂不匹配造成的。 

2) 降低反应体系中引物的用量，引物终浓度降至 0.2-0.1 μM 会有改善。必要时引物浓度可在 0.3 μM-0.05 μM 范围内进行调整，寻找合适的引物浓度。 

3) 而且，在进行Real Time PCR实验时，使用较低浓度的引物还会减少引物二聚体及其他杂峰的出现。注：对于首次使用 GoTaq^® qPCR Master Mix 的实验者，建议参考“A6001 试用指导”进行实验。

答：

1) 如图所示，当提取的 RNA 样品纯度不高时会出现。出现这种情况，提示 RNA 样品中有可能污染了基因组 DNA。 

2) 染料法 qPCR 的发光原理是染料特异性与双链 DNA 结合，两者结合后染料受激发才能产生光信号。如果 RNA 模板中污染有双链的基因组 DNA，会造成背景较高。 

3) 发生这种情况时，可先将 RNA 样品用 DNA 酶消化以去除污染的基因组 DNA，再进行反转录和定量 PCR，结果会有改善。 

答：

1) 熔解曲线的杂峰可能是引物二聚体或其他非特异性扩增，说明引物质量不是特别好。如果优化条件后杂峰消失，则引物仍旧能用于定量实验。如优化后杂峰无法去除，则可能需要重新设计引物。 

2) GoTaq qPCR Master Mix 比一般的荧光定量 PCR 试剂更灵敏，有可能检测到其他试剂检测不到的杂峰。而一般的以 SYBR Green I 为染料的荧光定量 PCR 试剂，由于 SYBR Green I 的荧光信号较低，杂峰较低时无法发现，只有把产物跑胶后发现非特异性条带、或做扩增效率的实验发现扩增效率>110%才能确认。 

3) 进行 Real Time PCR 实验时，使用较低的引物浓度会减少引物二聚体的出现。建议初次实验时采用0.2 μM 的终浓度（假设单个引物储存液的浓度是 10 μM，则每 20 μl 反应体系需加入 0.4 μl 引物）进行，如果出现引物二聚体，可将引物浓度进一步降低至终浓度 0.1 μM。 

答：

1) ABI 仪器，除 7500 和 7500FAST 之外其他的型号，如 7300、7900、StepOne、StepOne Plus 需要高浓度校正荧光染料，应加入 100×CXR 至 1×。 

2) 而对于 ABI 7500/7500FAST 和 Roche、Bio-Rad、Stratagene 等其他品牌的仪器，GoTaq qPCR Master Mix 试剂已经预混低浓度的校正荧光染料，不需要再加CXR。