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A5000标准反应程序和快速反应程序对比
相关产品目录号：A5000
产品分类：核酸提取/纯化
问题类型：产品选择指导
产品关键词：反转录，GoScript，标准反应程序，快速反应程序
快速反应程序（一般的RNA模板，快速反应条件仅适合于下游做qPCR）：
1. 将GoScriptTM反转录系统中各组分取出置于冰上融化后，按下表加入各组分，配制RT-Mix（按总反应体积20μl计算；通常配制RT-Mix要比实际样品数多1-2个，以防止液体挂壁造成的体积损失）：
| 组分 | 每反应加入量 |
| Nuclease-Free Water | 0.6μl |
| GoScript™ 5X Reaction Buffer | 4μl |
| MgCl2(25mM) | 4μl |
| Oligo(dT)15Primer (500μg/ml) | 0.5μl |
| Random Primers (500μg/ml) | 0.5μl |
| PCR Nucleotide Mix | 1μl |
| Recombinant RNasin® Ribonuclease Inhibitor | 0.4μl |
| GoScript™ Reverse Transcriptase | 1μl |
| 总体积 | 12μl |
2. 将配好的RT-Mix分至各反应管，加入总RNA（1-2μg）， 并加水将体积补齐至20μl：
| 组分 | 每反应加入量 |
| RT-Mix | 12μl |
| RNA(1-2μg) | __μl |
| Nuclease-Free Water | __μl |
| 总体积 | 20μl |
标准反应程序（mRNA长度较长或GC含量较高，>60%时）：
1. 取一定量模板RNA加入引物：
| 组分 | 每反应加入量 |
| RNA (最高5µg/reaction) | __μl |
| Oligo(dT)15Primer (0.5µg/reaction) | 1μl |
| Random Primers (0.5µg/reaction) | 1μl |
| Nuclease-Free Water (加至10μl) | __μl |
| 总体积 | 10μl |
2. 将模板RNA与引物的混合物进行70℃、5 min预变性，完成后取出置于冰上：
3. 设置以下程序进行反转录反应，包括42℃、15min的延伸和70℃、15min的反转录酶灭活：
4. 配制RT-Mix，每管加入10μl模板RNA与引物的混合物：
| 组分 | 每反应加入量 |
| Nuclease-Free Water | 1.6μl |
| GoScript™ 5X Reaction Buffer | 4μl |
| MgCl2(25mM) | 2μl |
| PCR Nucleotide Mix | 1μl |
| Recombinant RNasin® Ribonuclease Inhibitor | 0.4μl |
| GoScript™ Reverse Transcriptase | 1μl |
| 总体积 | 10μl |
5. 设置反转录程序，包括退火、延伸、逆转录酶失活三步。 程序完成后得到cDNA。
