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答题有奖 | GloMax® Galaxy细胞成像仪助力靶向蛋白降解研究精准可视化
本文利用HiBiT标记的GSPT1的目标蛋白降解来展示生物发光工作流程。GloMax® Galaxy细胞成像仪捕获了GSPT1的降解过程，使我们能够实时可视化目标随时间的丢失。通过生物发光成像，生物发光工作流程可以大大扩展，在靶向蛋白降解研究领域获得更精确的答案。
关键词：生物发光成像，细胞成像，荧光成像，靶向蛋白降解，PROTAC。
1. 背景介绍
靶向蛋白质降解（TPD）作为一种变革性的药物发现方法，为调控先前被认为是“不可成药”的靶点提供了可能性。与传统的仅阻断蛋白质功能的抑制剂不同，TPD利用小分子降解剂（如PROTACs、分子胶）来招募特定的蛋白质，并通过细胞内的泛素-蛋白酶体系统进行降解。
Promega作为提供蛋白质降解研究工具的领导者之一，开发的HiBiT蛋白标签系统已然成为了研究小分子降解剂调节目标蛋白水平的首选工具。这种由11个氨基酸组成的肽段提供了一种强大且灵敏的方法，用于实时监测蛋白质水平。HiBiT可以通过CRISPR/Cas9基因编辑插入基因组中，与内源表达的感兴趣蛋白融合，并使用互补的LgBiT蛋白和一种发光底物以高灵敏度检测。下图展示了在细胞内部存在LgBiT的情况下，HiBiT如何引发发光现象。
细胞内部HiBiT融合蛋白与 LgBiT互补的示意图。由HiBiT产生的生物发光可以用来追踪蛋白质的位置、活性和表达情况。生物发光的消失表明蛋白质被降解。
GloMax® Galaxy细胞成像仪能够捕捉到HiBiT产生的生物发光信号，从而提供了一种方法来验证HiBiT模型系统是否正确代表了所需的生物学特性。这一初始确认步骤对于在实验流程中进一步表征靶蛋白降解至关重要。当LgBiT在细胞中表达时，可以通过发光底物生成的生物发光信号进行量化和可视化，这使得可以实时评估目标蛋白的丰度，并计算关键参数如降解速率和最大降解水平（Dmax），以帮助开发具有最佳性能特征的降解剂化合物。
在开发用于评估降解剂的HiBiT敲入细胞模型时，传统上验证生物发光信号是否反映了预期的生物学特性通常是一个繁琐且具有挑战性的过程[1]。显微镜技术能够在混合细胞群体的背景下对细胞进行表征，并深入了解通过传统的平板读数仪难以辨别的因素。这包括区分响应者与非响应者的能力、识别稀有事件以及确定信号的空间分辨率以了解特定过程在细胞中的发生位置。最常见的显微镜形式是荧光显微镜；然而， HiBiT敲入细胞系产生的是生物发光信号，是使用GloMax®平板读数仪等发光检测仪测定，若需使用荧光显微镜，就需要对这些细胞进行额外的修饰。在检测方法的确认过程中，也遇到了类似的挑战，因为之前的成像设备在充分利用生物发光信号方面存在困难。使用GloMax® Galaxy进行成像进一步改善了生物发光工作流程，因为它使能够对生物发光检测，如HiBiT标记蛋白的降解，进行显微镜分析。
2. 应用示例
(1)GSPT1的目标蛋白降解
GSPT1（G1至S期转换因子1）是一种参与细胞增殖和存活的翻译终止因子[2]。它与白血病的发展有关，使其成为降解研究的一个吸引人的靶点[3]。为此目的开发了一种分子胶降解剂CC-885，它促进GSPT1的泛素化及其随后的降解[4]。CC-885与E3连接酶CRBN结合，改变其表面和特异性，从而使其能够与新底物GSPT1相互作用，最终导致其降解。由于分子胶与CRBN的结合并由此产生构象变化，理解其对目标蛋白的特异性是很重要的。通过我们的靶向蛋白质降解服务提供的新底物面板可以评估包括GSPT1在内的目标蛋白和脱靶蛋白的降解。
鉴于GSPT1特性已被充分表征及其在细胞增殖中的已确立作用，我们选择了它作为靶标，使用HiBiT assay来观察其降解。为了表征HiBiT标记的GSPT1的降解，我们执行了以下步骤：
1.60,000至75,000个HiBiT-GSPT1 HEK293细胞被接种到Ibidi 8孔微室板的各个孔中，每孔体积为200μl，并过夜培养；
2. 为了引发发光信号，我们制备了2倍浓度的Nano-Glo® Vivazine®底物（通过1:50的稀释比例在Opti-MEM中稀释储备液）并用来替换每个孔中大约一半的总体积；
3.在进行发光测量之前，细胞先培养1小时以达到平衡状态，然后给予不同浓度的CC-885；
4. 发光信号每隔15分钟测量一次，持续24小时。
如下图所示，随着CC-885剂量的增加，HiBIT-GSPT1 HEK293细胞产生的发光信号逐渐减少。当加入约100nM或更高浓度的CC-885时，观察到了一致且快速的发光信号丧失。
这些HiBiT标记的细胞系可通过我们的CRISPR ready-to-use cell lines获得。
（2）通过生物发光成像确认结果
如上所示，随着CC-885剂量的增加，HiBiT-GSPT1细胞中的生物发光显著减少，符合预期。然而，重要的是要认识到这种发光信号代表了在发光仪上同时读取的许多细胞的综合输出。为了更详细地了解CC-885对GSPT1蛋白水平的影响，需要一个更清晰的生物发光表达模式图像，特别是为了理解单细胞水平上的降解。分析表达模式，如亚细胞定位，显著增强了蛋白质降解研究的洞察力。
为了确认在HiBiT-GSPT1细胞暴露于CC-885时引发的TPD，使用GloMax® Galaxy细胞成像仪进行了长期动力学成像。这一确认步骤是必要的，以验证生物发光结果是否被正确捕捉，并与发光仪读数相一致。成像生物发光提供了关于区室降解、降解在细胞群体中的代表性以及细胞间降解速率更深的理解。
为了捕获GSPT1降解的图像，我们使用了之前描述的步骤来诱导HiBiT标记的GSPT1的降解。下面这些额外步骤是为了在GloMax® Galaxy细胞成像仪上捕捉GSPT1降解的图像而执行的：
- GloMax® Galaxy内的环境微室通过Stagetop培养箱/控制器提供了持续37°C和5% CO2的条件；
- 在加入100nM CC-885降解剂或DMSO之前收集基线图像；
- 图像连续采集，每次曝光时间为3分钟，持续5小时。
下图显示了HiBiT-GSPT1在五小时内降解的视频。加入CC-885后，生物发光显著减少，如第二列和第三列所示。在图像中显示的细胞数量范围内，生物发光信号的降解表现得相当一致，表明细胞群体中的降解相对均匀。DMSO的加入导致的生物发光减少量极小，这验证了生物发光减少是由分子胶引起的。DMSO处理细胞中生物发光的小幅降低代表了HiBiT在长时间成像过程中的自然信号衰减。明场成像显示，在整个成像期间细胞结构保持相对不变。然而，用CC-885处理的细胞边缘有轻微“卷曲”，可能表示细胞死亡的开始。
使用GloMax Galaxy®细胞成像仪捕捉到的HiBiT标记GSPT1的靶向蛋白质降解（TPD）生物发光图像。
该研究突出了使用GloMax® Galaxy细胞成像仪进行蛋白质降解实时成像的转变，通过启用生物发光成像增强了TPD工作流程。对生物发光信号进行成像极大地改进了测定工作流程，并减少了传统荧光成像中常见的困难，包括更高的信噪比和减少的光毒性。这款仪器是Promega为分析如TPD等复杂生物过程所提供的工具套件中的最新成员。通过不断在生物发光领域取得突破，Promega展示了其致力于赋予研究人员在TPD研究中获得更精确和深刻结果的决心。
参考文献：
1. Madsen, R. R., & Semple, R. K. (2019). Luminescent peptide tagging enables efficient screening for CRISPR-mediated knock-in in human induced pluripotent stem cells. Wellcome Open Research, 4, 37. https://doi.org/10.12688/wellcomeopenres.15119.1
2. Matyskiela, M. E., et al. (2016). A novel cereblon modulator recruits GSPT1 to the CRL4 CRBN ubiquitin ligase. Nature, 535(7611), 252–257. https://doi.org/10.1038/nature18611
3. Sellar, R. S., et al. (2022). Degradation of GSPT1 causes TP53-independent cell death in leukemia while sparing normal hematopoietic stem cells. Journal of Clinical Investigation, 132(16). https://doi.org/10.1172/JCI153514
4. Xuan Long, et al. (2021). Identification of GSPT1 as prognostic biomarker and promoter of malignant colon cancer cell phenotypes via the GSK-3β/CyclinD1 pathway. Journal on Aging.
与荧光成像相比，生物发光成像具有多个优势，包括其适用于研究动态的功能事件和目标定位。不同于荧光显微镜，生物发光不需要激发光源，因为发光信号是由底物参与的生化反应产生的。这消除了荧光显微镜中常见的光毒性和光漂白风险，并且由于细胞培养物中的背景发光较低，提供了更高的信噪比。
GloMax® Galaxy细胞成像仪是一种多功能工具，利用NanoLuc®萤光素酶技术（如HiBiT）来研究活细胞和固定细胞及组织中的蛋白质动态。它专为检测方法的开发而设计，结合了发光成像、荧光成像和明场成像功能，能够对细胞参考标记物和细胞形态进行全面分析。可选的Stagetop培养箱附件通过调节温度、湿度和气体环境，允许进行长期动力学成像。
